POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR)
|
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR) İnsan ve hayvanlarda hastalık ve bozuklukların teşhisi değişik yöntemlerle olmaktadır. Klinik belirtilerin görülmesi ile şüphelenilen hastalıklar değişik görüntüleme yöntemleri, değişik laboratuar tetkikleri ile desteklenerek teşhise gidilmektedir. Bakteriyel, viral, paraziter teşhislerde konvansiyonel yöntemlerin yanında serolojik yöntemlerle de teşhis desteklenmektedir. Serolojik testlerin duyarlılıkları, özgünlükleri, kros reaksiyon oluşturma gibi özellikleri bilim insanlarını daha özgün, somut arayışlara itmiştir. Bu çalışmalardan biride moleküler düzeyde yapılan genetik çalışmalardır. Gen DNA zincirindeki belli bir uzunluktaki birimdir. Kromozom DNA'nın özel bir şekilde paketlenmesi sonucu oluşan bir yapıdır. Her kromozomda çok sayıda gen vardır. Her bir gen diğerinden farklı bir şifre içerir ve farklı bir proteini kodlar. Eğer vücutta bir genin kodladığı proteine gereksinim varsa o gen aktif hale geçerek üzerindeki şifre, messenger (haberci) RNA adı verilen bir yapı şeklinde kopyalanır. Bu yapı hücrenin sitoplâzmasındaki ilgili birimlere gelerek kalıp vazifesi görür ve o proteinin yapımı sağlanır. Genler içerdikleri şifreler dolayısıyla vücuttaki her türlü olayı kontrol ederler. Bazı genler vücuda gerekli kimyasal yapıların ortaya çıkmasını sağlarken bazı genler diğer genler üzerinde düzenleyici olarak şifrelenmiştir. Bu genlerin çalışabilmesi için bir uyarana ihtiyaç vardır. Vücudun tiroit hormonuna olan gereksinimi artar ya da herhangi bir nedenle kanda tiroit hormonlarının miktarı azalırsa önce beyinde bulunan hipofizdeki ilgili gen, TSH hormonunun yapımını sağlar bu hormon kan yoluyla tiroit hücresine ulaşır ve hücrenin zarına yapışarak çekirdekteki hormon yapımını sağlayacak olan genlere mesaj iletir. Bu mesajı iletecek olan kimyasal yapılar da başka bir gen tarafından yaptırılmakta ve hücre içindeki miktarı düzenlenmektedir. Çekirdekte bu mesajı alan gen tiroit hormonlarını yaptırmak üzere gerekli şifreyi RNA adı verilen bir haberci ile hücrenin sitoplazmasına gönderir ve hormon yapımı başlar. Dünyada canlıları oluşturan genetik yapı her zaman merak konusu olmuştur. Değişik Varsayımlar yerini zamanla daha somut verilere terk etmiştir. Genetik düzeyde yapılan çalışmalarda genetik yapının belirlenmesi, genlerin yerleşim yerlerinin saptanması, bu genlerin işlevlerinin saptanması, aralarındaki ilişkilerin şeklinin saptanması merak edilen konular olmuştur. Bu amaçla değişik çalışmalar yapılmış, Mullis tarafından geliştirilen polimeraz Zincir Reaksiyonu genetik düzeyde bir çığır açmıştır. İlk kez 1985 yılın da insanlığın hizmetine sunulan Polimeraz Chain Reaction (PCR) yöntemi günümüzde daha da geliştirilerek insan ve hayvan sağlığında hastalık ve bozuklukların teşhisinde büyük avantajlar sağlamaktadır. Moleküler biyolojideki gelişmeler, yüksek spesifite ve sensitiviteye sahip yeni teşhis metotlarının geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Moleküler teşhis metotları insan ve hayvan sağlığında da yoğun olarak kullanılmaya başlanmıştır. Viroloji, Bakteriyoloji, Parazitoloji alanlarında da başvurulan çeşitli moleküler metotların yanında, PCR kullanımı daha yaygınlaşmış, çok sayıda türün kesin teşhisi mümkün olmuş, hatta yeni türlerin varlığı bu yöntemle ortaya konmuştur. Genetik düzeyde moleküler biyolojik bir yöntem olan PCR da temel olay invitro (canlı organizma dışında) şartlarda çalışılması istenen hastalık ya da bozukluğa ait genin ya da özgün bir DNA dizisinin çok sayıda kopyasının elde edilmesidir. Elimizde daha önce bulunan DNA dizilimi ya da kalıp eğer aradığımız materyalde de varsa aynen doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR replikasyon sürecini taklit ederek değişik sayıdaki sikluslarda kalıp DNA dizisinin milyar katını kopyalar. Daha sonra saf olarak elde ettiğimiz bu kopyaların görünür hale gelmesi için Jel Elektroforez ya da Real Time yöntemler kullanılmaktadır. PCR da çalışılan DNA dizilerinin jenerasyonlara bağlı replikasyonları çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilmiş olur. PCR sadece DNA için yapılabilir. Eğer RNA için PCR yapılmak istenirse, öncelikle RNA’dan revers transkripsiyonla cDNA elde edilmelidir. Bir çeşit invitro kopyalama olan her Polimeraz Zincir Reaksiyonu, istenilen sayıda tekrarlanabilen döngülerden oluşur. Bir PCR döngüsü sırasıyla, deoksiribonükleikasidin (DNA) iki zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılması (Denaturation); sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanması (Annealing) ve zincirin yeni çift zincirli DNA'lar oluşturacak şekilde uzaması (Extension) aşamalarından meydana gelir. Bu siklustaki aşamalar değişik sıcaklık derecelerinde olmaktadır. Polimeraz enzimlerinin yüksek sıcaklık derecelerinden etkilenmemeleri gerekir. Orijinal PCR teknolojisinde, ilk önceleri, E.coli ' den izole edilen DNA polimeraz enzimi kullanılmıştır. Bu enzim termolabil olduğundan ısının 95°C’ye çıkarılması halinde, enzim inaktive olmaktaydı. Bu dezavantajı gidermek için, her siklusta yeniden enzim katılması zorluğu, ısıya dayanıklı enzimin bulunması gereğini ortaya koymuştur. İlk termostabil DNA polimeraz, Thermus aquaticus’dan izole ve pürifiye edilmiştir Bu mikroorganizma Yellow Stone Ulusal Parktaki sıcak su kaynaklarından izole edilmiştir. Aslında PCR doğal hücre bölünmesini taklit eder. Replikasyon sürecini tekrarlayarak istenen DNA dizisini defalarca kopyalar. DNA çift zincirinde birbirinden ayrılan ipliklerin tamamlayıcıları sentezlenerek bir DNA molekülünden onunla aynı olan iki yavru molekül meydana gelir. Buna göre hücre bölünmesi ile yeni oluşan hücrelere tüm genler aynen aktarılmış olur. Her yeni hücre jenerasyonunda genlerin kopya sayılarının iki katına çıkması nedeni ile jenerasyonlar boyunca DNA miktarı başlangıca göre üssel olarak artar. Tüm DNA’nın eşlenmesi yerine, DNA’nın sadece bir parçası ve çok sayıda eşlenir. Replikasyondaki gibi PCR’de de: Çift zincirin ayrılması, Primer bağlanması ve Polimerizasyon aşamaları gerçekleşir. Günümüzde PCR yöntemleri modifiye edilerek Nested PCR, RT-PCR, Real-Time PCR gibi on dörtten fazla PCR çeşidine ulaşmıştır. Konvansiyonel PCR daÜrünü sadece PCR’dan sonra inceleyebiliriz PCR ürününden kontaminasyonlar olabilir Kantitatif değildir. Çalışılan iki farklı örnekte, bunların farklı sayıda kopyalandığı düşünülürse; kopyalanan sayı farklı olsa bile elde edilen ürünlerin elektroforezde oluşturduğu band yoğunluğu aynı görülür Real Time PCR da ise; Primerlerden başka prob’lar lkullanılır, PCR oluşurken her PCR reaksiyonu izlenebilir, Düşük ve yüksek miktardaki template konsantrasyonlarında lenearite PCR ürünü reaksiyon tübünde saptandığı için agaroz jel kullanımına gerek yoktur, Kontaminasyon riski azalır, Sensitivitesi yüksektir. PCR kullanımı çok geniş alanlarda kendini göstermektedir. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın teşhisinin yapılması, Doğum öncesi genetik bozuklukların belirlenmesi Şüphe edilen viral, bakteriyel, paraziter, mikotik hastalıklarda etkenlerin belirlenmesi, Adli olayların aydınlatılmasında Kanser ile ilgili çalışmalarda, Canlı ortam dışında gerçekleştirilecek sperm ve ovum birleştirmelerinde implantasyon öncesinde genetik tetkiklerin yapılması ve bebekte muhtemel problemlerin ekarte edilmesi, Genetik düzeyde yapılacak tüm çalışmalarda PCR kullanımı mümkün olmaktadır.
|
|||||
|
Kütüphanemizden İlginizi çekebilecek
diğer bazı makaleler:
|
|||||
|
|
